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動物源性食品中抗病毒類藥物殘留量測定的前處理方法

點擊次數:2803  更新時間2021-04-02  【關閉

    抗病毒類藥物的危害及檢測目的

    抗病毒類藥物主要包括金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛、嗎啉胍等。金剛烷胺和金剛乙胺是第/一批被允許用來治療A型禽流感病毒的*藥,兩者都屬于穿入和脫殼抑制劑,抑制病毒的繁殖。研究發現,金剛烷胺可以引起角膜水腫,高劑量攝入時表現出一定的毒性。美金剛和金剛乙胺互為同分異構體,但其性質和作用機理卻并不相同。美金剛原被廣泛用于中樞神經系統的治療,具有一定的神經毒性。嗎啉胍又被稱為病毒靈,是一種廣譜抗病毒類藥物,對甲型和乙型流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞體病毒等有較好的治療效果,劑量過大會引起多汗、惡心、低血糖等不良反應。我國在1999年12月將嗎啉胍列為禁用藥,2005年中華人民共和國農業部第560號公告將金剛烷胺、金剛乙胺、利巴韋林和嗎啉胍這4種抗病毒類藥物列為禁用獸藥,禁止用于動物生產。雖然抗病毒/藥屬動物禁用藥物,但其在動物養殖過程中依然被廣泛使用。若飼養者不科學、不合理地使用該類藥物,易導致藥物在畜禽機體內殘留與富集,不僅會造成畜禽中毒,也會引起病毒耐藥毒株的出現,使抗病毒/藥物有效性降低,其耐藥性也有轉移擴散到人體的風險,對消費者的健康存在很大的隱患。

    本文闡述了如何將抗病毒類藥物從樣品基質中分離提取出來,并經過凈化后,轉化成液質聯用儀可以檢測的形式。以提取、凈化為重點,依據行標SN/T 4253-2015,為檢測人員和相關領域研究人員提供一定的參考。

     
     
     
     

    檢測項目:金剛乙胺、金剛烷胺、美金剛、嗎啉胍、咪喹莫特、奧司他韋、阿昔洛韋

    應用范圍:雞肉、雞肉制品、豬肉、肝臟、魚、蝦、蛋、皮蛋等動物組織

     
     
     
    液相色譜-質譜/質譜法
     
     
     

    方法原理:試樣中7種抗病毒類藥物用三氯乙/酸-乙腈混合溶液提取并沉淀蛋白,經混合型陽離子交換固相萃取柱凈化后,液相色譜-質譜/質譜儀測定,內標法定量。

    前處理儀器:分析天平(感量0.1 mg和0.01 g);組織搗碎機、高速冷凍離心機(4 ℃冷凍,18000 r/min);離心機(5000 r/min);渦旋混合器;pH計;氮吹儀;固相萃取裝置。

    檢測儀器:HPLC-MS/MS+ESI

    試樣制備與保存

    雞肉、肝臟、魚肉放在組織搗碎機均質,充分混勻,均分成2份,分別裝入清潔容器內,并標明標記;雞肉制品取雞肉部分;蛋、蝦去殼后取可食部分放在組織搗碎機均質,充分混勻,均分成2份,分別裝入清潔容器中,并標明標記。

    制樣操作過程中,應盡可能防止樣品受到污染或發生殘留物含量的變化。

    試樣于-18 ℃以下保存,新鮮或冷凍的組織樣品可在2 ℃~6 ℃貯存72 小時。

    前處理方法

     
     
     
    1.提取
     
     
     

    稱取試樣5 g(精/確至0.01 g)于50 mL離心管中,加入0.1 mL內標標準工作溶液(0.1 μg/mL),加入15 mL三氯乙/酸乙腈(90+10)溶液,加蓋后在超聲波發生器中超聲10 min,再旋渦混勻3 min,4 ℃條件下15000 r/min離心5 min,取出上清液,再加入10 mL三氯乙/酸乙腈溶液重復提取一次,離心后合并上清液至25 mL的容量瓶中,用乙腈定容至刻度。

     
     
     
    2.凈化
     
     
     

    分別用3 mL甲醇、3 mL水和3 mL2 %甲酸水溶液活化混合陽離子交換固相萃取小柱(60 mg,3 mL),準確移取5 mL上清液加入到小柱中,依次用5 mL2 %甲酸水溶液和3 mL 1 %甲酸乙腈淋洗,棄去全部流出液;然后真空抽干小柱5 min,用4.0 mL洗脫溶液(氨水乙酸銨甲醇2.5+2.5+95)洗脫至10 mL玻璃管中,在50 ℃用氮氣濃縮儀吹至近干。準確加入1.0 mL乙腈-甲醇-水溶液(70+10+20)溶解殘渣,渦旋30 s后過0.2 μm濾膜,供液質測定。此樣液應在48 h內測定完畢。

    注意事項

    1.標準物質分別用甲醇配制成100 μg/mL的標準儲備液,其中阿昔洛韋先用少量二甲基亞砜溶解,再用50 %甲醇水配成100 μg/mL的標準儲備液,在-18 ℃避光保存,可使用6個月。

    2.本方法使用了金剛烷胺D6、美金剛D6、阿昔洛韋D4同位素內標進行回收率的校正。

    3.本方法使用三氯乙/酸-乙腈提取并沉淀蛋白,MCX固相萃取柱凈化。

    4.MCX固相萃取柱的凈化過程是“酸上樣、堿洗脫”。淋洗后一定抽干小柱,防止水相進入洗脫液。氨化洗脫液一定要現用現配,防止氨水揮發,導致目標化合物洗脫不下來。

    5.氮氣濃縮過程中,吹至近干潮濕狀態,定容后采取渦旋加超聲的方式復溶,可以提高回收率。

    6.金剛烷胺的殘留檢測,有GB 31660.5-2019作為依據,應根據需求進行選擇使用。并注意其他藥物檢測方法的更新。

     

    參考文獻

    SN/T 4253-2015 出口動物組織中抗病毒類藥物殘留量的測定 液相色譜―質譜/質譜法

     

    抗病毒類藥物殘留量測定的前處理流程圖

     

    抗病毒類藥物標準品信息表

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